來源：生物探索 核旁斑組裝轉錄本1 (NEAT1)是一種高度豐富且保守的長鏈非編碼 RNA (lncRNA)，從多發性內分泌腫瘤 (MEN) 基因座轉錄，編碼 NEAT1-1（或 MEN-ε，~3.7 kb）和 NEAT1-2（或 MEN-β，~22.7 kb）。NEAT1-2 lncRNA是核旁斑 (paraspeckles)的主要結構支架。它招募多種 RNA 結合蛋白 (RBP)，包括 NONO、SFPQ、FUS 和 TDP43，驅動液-液相分離 (LLPS) 并塑造這種動態、無膜、和分層的核體。通過組織和調控核內多種重要RBP的定位和富集，NEAT1 在調節染色質狀態、轉錄、剪接、RNA 加工和穩定性【1, 2】，以及在器官發育、神經變性、抗病毒免疫和癌癥中發揮多種功能【3, 4】。 NEAT1，MALAT1，以及其他至少130個后生動物的lncRNA 缺失穩定多數mRNA的 3′ poly(A) 尾。這些lncRNA則利用它們3′ 末端的穩定RNA三螺旋（triplex）結構以免受外切核酸酶快速降解【5, 6】。NEAT1 和 MALAT1的前體均通過模仿tRNA結構以招募RNase P切割其5′ 引導序列，產生成熟lncRNA。與此同時，被RNase P切割后的tRNA類似結構生成兩個新的小非編碼RNA，被分別命名為mascRNA （來自MALAT1）和menRNA（來自NEAT1）【7】。隨后，ELAC2（ElaC同源蛋白2，或RNase Z）去除menRNA 的3′ 尾部，然后CCA-添加酶對mascRNA 和menRNA添加3′ CCA尾。這里，有趣的是mascRNA僅接收一次CCA 添加，形成類似tRNA的正常3′ CCA末端尾。然而menRNA 連續接受兩次CCA加尾，形成較長的CCACCA尾，造成了核酸外切酶的a招募而在胞內快速降解【8】。 目前為止menRNA 的三維結構仍然未知。關于menRNA重復加尾的分子機制，一個從蛋白質角度出發的“分子臺虎鉗 （molecular vise）”模型提出，在第一次添加 CCA 時，CCA添加酶的“頭部”區域通過自身的螺旋運動并協同在遠端靜態固著在menRNA臂肘（elbow）的“尾部”區域對menRNA或者有結構缺陷的tRNA進行旋轉性的機械壓縮，造成menRNA局部構象變化，產生一個三個堿基長的側面凸起，剩余的堿基重新配對，從而實現RNA底物重置，可以重復添加 CCA【9】。然而，目前尚不清楚menRNA是否只是被動地被蛋白酶操控，或者通過調控其自身構象從而指導蛋白酶的功能，以決定其自身的命運。并且，上述模型中蛋白機械做功的能量來源，以及此酶需要對RNA施加多大的扭矩來驅動其構象改變，并不明確。 2024年7月18日，美國國立衛生研究院（NIH）資深研究員張金偉研究組在Nature Structural & Molecular Biology雜志上再次發表題為Structural basis of NEAT1 lncRNA maturation and menRNA instability的文章解析首個menRNA晶體結構。menRNA結構和張金偉研究組最近報道的mascRNA結構整體相當類似【10】，但是在氨基酸接受莖環區域有序列上，結構上和穩定性上的差異, 為menRNA之后發生構象變化奠定了基礎。 綜上，一大類后生動物內以NEAT1 和MALAT1為例的lncRNA采用一種新穎的、異常精簡的準tRNA結構來招募指定的tRNA加工酶，同時避免被其他不利的tRNA酶識別，以驅動精準定制的RNA生成、加工和成熟。在核內實現NEAT1 成熟和穩定化之后，menRNA 氨基酸接受莖環區域特異的的序列和結構造成熱力學驅動的自主構象轉變和莖區配對重組，從而操控CCA添加酶實現兩輪CCA添加，促進其自身的快速降解。因此，menRNA的這種作用模式類似于原核生物里廣泛存在的轉錄衰減子和核糖開關。后期出現的下游RNA序列改變了整體RNA的最穩定構象，通過熱力學過程驅動預先指定的自身構象轉變。這種趨同機制賦予了多種非編碼RNA實質性的構象自控能力，并通過自主構象變化來指導RNA聚合酶、核糖體和RNA加工酶發揮RNA預先制定的功能，最終自身決定這些RNA在轉錄、翻譯和降解過程的命運。 參考文獻： 1. Butler, A.A., et al., Long noncoding RNA NEAT1 mediates neuronal histone methylation and age-related memory impairment. Sci Signal, 2019. 12(588). 2. Hirose, T., et al., NEAT1 long noncoding RNA regulates transcription via protein sequestration within subnuclear bodies. Mol Biol Cell, 2014. 25(1): p. 169-83. 3. Adriaens, C., et al., p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity. Nat Med, 2016. 22(8): p. 861-8. 4. Imamura, K., et al., Long noncoding RNA NEAT1-dependent SFPQ relocation from promoter region to paraspeckle mediates IL8 expression upon immune stimuli. Mol Cell, 2014. 53(3): p. 393-406. 5. Zhang, B., et al., Identification and Characterization of a Class of MALAT1-like Genomic Loci. Cell Rep, 2017. 19(8): p. 1723-1738. 6. Brown, J.A., et al., Formation of triple-helical structures by the 3'-end sequences of MALAT1 and MENbeta noncoding RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(47): p. 19202-7. 7. Wilusz, J.E., S.M. Freier, and D.L. Spector, 3' end processing of a long nuclear-retained noncoding RNA yields a tRNA-like cytoplasmic RNA. Cell, 2008. 135(5): p. 919-32. 8. Wilusz, J.E., et al., tRNAs marked with CCACCA are targeted for degradation. Science, 2011. 334(6057): p. 817-21. 9. Kuhn, C.D., et al., On-enzyme refolding permits small RNA and tRNA surveillance by the CCA-adding enzyme. Cell, 2015. 160(4): p. 644-658. 10. Skeparnias, I., et al., Structural basis of MALAT1 RNA maturation and mascRNA biogenesis. Nat Struct Mol Biol, 2024.
作者而后通過酶動力學、時間相關單光子計數 (TCSPC)、圓二色性 (CD)、實時熒光定量PCR等多種生物化學和生物物理手段揭示了menRNA招募RNase P， ELAC2， 和CCA-添加酶等多個tRNA加工酶的分子機理。利用高精度時間相關單光子計數 (TCSPC) 和圓二色性 (CD) 分析，文章作者發現3’端帶有一個CCA尾的menRNA在沒有蛋白酶結合或者作用的情況下自身發生了顯著構象變化，自主產生了三堿基的側凸并重組了附近的堿基配對，以此指示CCA添加酶進行第二輪的CCA添加。然后，文章作者去除了CCA添加酶的尾部或者與尾部直接接觸menRNA的臂肘區域，發現第二輪CCA添加仍然可以正常進行。這些實驗結果與之前提出的分子臺虎鉗模型明顯不符【9】，并且與menRNA驅動自身構象轉變的新機理模型完全一致。