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Mol Cell | 李笑雨/伊成器團隊合作開發不依賴于亞硫酸氫鹽RNA m⁵C單堿基測序檢測方法

來源：生物世界

RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是一種保守的轉錄后修飾，廣泛分布在rRNA、tRNA和mRNA上。mRNA上的m5C修飾主要由NSUN2和NSUN6等甲基轉移酶催化產生，并且可以被TET家族蛋白和ALKBH1進一步氧化到hm5C，f5C和ca5C【1】。RNA m5C修飾可以被特定的結合蛋白所識別進而參與基因表達調控，如近年來國家生物信息中心楊運桂團隊在RNA m5C修飾研究中取得了系列突破性成果，報道了包括ALYREF, YBX1, YBX2和SRSF2在內的多個結合蛋白及其調控功能【2-6】，極大地推動了對于RNA m5C修飾生物學功能的理解。

對于RNA m5C修飾功能的探究依賴于靈敏精準的檢測技術。目前RNA m5C修飾檢測主要依賴于亞硫酸氫鹽測序（bisulfite sequencing，BS-seq），在BS-seq中未修飾的胞嘧啶（C）被轉變為尿嘧啶（U），而m5C保持不變，因此通過檢測未轉變C即可實現對于m5C修飾的鑒定。雖然BS-seq操作簡單便捷，并且可以實現單堿基分辨率m5C修飾的定量檢測，但是其存在三個主要不足之處：1）間接檢測m5C，依賴于未修飾C的高效轉換，轉換不完全可能會導致假陽性；2）反應條件苛刻，導致RNA降解，限制低起始量樣本和低豐度RNA的檢測；3）C轉變為U后序列復雜度降低，影響比對準確度，限制低序列復雜度RNA 上m5C的檢測。盡管一系列優化措施如使用ACT三元堿基隨機引物提高檢測精準度與靈敏度【2】、優化分析流程【7】、利用無修飾RNA文庫校正【8】和 Ultrafast BS反應條件提高轉換效率【9】等，顯著提升了BS-seq的檢測精準度，但由于mRNA m5C修飾水平較低（中位數約為20%以下），對于依賴間接檢測的BS-seq，低復雜度序列以及低修飾比例位點的靈敏檢測仍是挑戰。雖然目前已有多種不依賴亞硫酸氫鹽的RNA m5C檢測方法被報道，但是這些方法各有局限，均無法實現全轉錄組水平RNA m5C修飾單堿基分辨率無偏檢測。

2024年7月12日，浙江大學醫學院李笑雨研究員聯合北京大學生命科學學院伊成器教授在Molecular Cell發表了題為Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach的研究論文，該研究開發了一種不依賴于亞硫酸氫鹽的檢測新技術，m5C-TAC-seq（m5C detection strategy enabled by TET-assisted chemical labeling），實現了全轉錄組水平m5C位點單堿基分辨率的精準、靈敏檢測。

這項技術的核心原理是將酶促反應與化學標記相結合，利用優化后的TET酶促反應將RNA m5C氧化至f5C，進一步使用疊氮茚二酮（AI）對于氧化產生的f5C進行特異性標記，標記產物不僅可以產生C-to-T的轉變，并且還可以通過點擊化學反應進行富集，從而實現對于m5C修飾單堿基分辨率的直接檢測（圖1A）。這一直接檢測的特性使其能夠靈敏檢測修飾比例低至2.5%的位點（圖1B）。此外該方法還具有反應條件溫和、不影響轉錄組堿基組成的特點，因此可以應用于低豐度和低序列復雜度的轉錄本。同時，結合multiplexing文庫構建策略，不僅可以減少樣品之間的技術誤差，并且能夠實現m5C修飾的半定量檢測。

圖1：m5C-TAC-seq可以實現單堿基分辨率m5C位點檢測。A. m5C-TAC-seq原理及流程圖；B. m5C-TAC-seq計算的C-to-T轉化率與m5C修飾比例呈現正相關；C. m5C-TAC-seq可以實現對于rRNA已知位點與未知位點的靈敏檢測；D. 未修飾HeLa轉錄組文庫對照分析提示2,499個m5C位點中只有6個位假陽性位點；E. 四元堿基組成大大提高了比對準確度；F. caRNA上m5C修飾位點分布（Credit: Molecular Cell）

為了評估m5C-TAC-seq的靈敏性和準確性，研究人員首先將其應用于rRNA和tRNA上。在rRNA上，m5C-TAC-seq不僅能夠精準檢測已知的高m5C修飾位點，并且還鑒定了一個新的低修飾位點m5C3683及其修飾酶（圖1C），驗證了m5C-TAC-seq的靈敏度。此外，對于具有復雜二級結構且序列復雜度較低的tRNA，m5C-TAC-seq不僅能夠鑒定所有已報道位點及其修飾酶，并且由于保留了四元堿基組成使得其可以實現對不同tRNA isodecoder的精準檢測。利用m5C-TAC-seq，研究人員繪制了HeLa、HEK293T和mESC的單堿基分辨率m5C修飾圖譜，分別鑒定了2499、765和664個m5C位點，并利用無修飾轉錄組文庫進行對照分析驗證了這些位點的可靠性（圖1D）。更為重要的是，鑒定了絕大多數m5C位點的甲基轉移酶，進一步確認了這些位點的準確性。此外，與BS-seq相比，m5C-TAC-seq在低修飾位點的檢測上也表現出高精度和高靈敏度，提示其直接檢測策略的魯棒性。

進一步研究發現，除了已知的NSUN2和NSUN6，rRNA甲基轉移酶NSUN5也可以作用于mRNA，這一發現與近期中山大學張銳團隊開發的高靈敏motif分析工具iMVP在mRNA上鑒定到的NSUN5 motif一致【10】。此外，利用m5C-TAC-seq，研究人員還發現在mESC的分化過程中，大部分mRNA上m5C位點呈現甲基化水平下調趨勢，并且富集在細胞周期及細胞分裂相關通路的轉錄本上，提示了m5C修飾可能參與到mESC分化過程中。得益于溫和的反應條件及對堿基組成的保留（圖1E），m5C-TAC-seq實現了對含有大量低復雜度序列的chromatin-associated RNA（caRNA）上m5C位點的鑒定（圖1F），提示了四元堿基的保留對于低復雜度序列上m5C修飾檢測的重要性。

綜上所述，該研究開發了直接檢測m5C修飾的新技術m5C-TAC-seq，并展示了m5C-TAC-seq技術高靈敏、高精準的檢測特性。m5C-TAC-seq不僅可以應用于包括低豐度、低序列復雜度在內的多種類型RNA和低修飾比例m5C位點的檢測，并且可以實現在多種生物學過程中m5C修飾的動態檢測，將有助于理解和推動RNA m5C修飾生物學功能的探究。

參考文獻：

1 Chen, Y. S., Yang, W. L., Zhao, Y. L. & Yang, Y. G. Dynamic transcriptomic m(5) C and its regulatory role in RNA processing. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 12, e1639, doi:10.1002/wrna.1639 (2021).

2 Yang, X. et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m(5)C reader. Cell Res. 27, 606-625, doi:10.1038/cr.2017.55 (2017).

3 Chen, X. et al. 5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat. Cell Biol. 21, 978-990, doi:10.1038/s41556-019-0361-y (2019).

4 Yang, Y. et al. RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol. Cell 75, 1188-1202 e1111, doi:10.1016/j.molcel.2019.06.033 (2019).

5 Wang, X. Z. et al. RNA 5-methylcytosine regulates YBX2-dependent liquid-liquid phase separation. Fund Res-China 2, 48-55, doi:10.1016/j.fmre.2021.10.008 (2022).

6 Ma, H. L. et al. SRSF2 plays an unexpected role as reader of m(5)C on mRNA, linking epitranscriptomics to cancer. Mol. Cell 83, 4239-4254 e4210, doi:10.1016/j.molcel.2023.11.003 (2023).

7 Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N. & Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nat. Struct. Mol. Biol. 26, 380-388, doi:10.1038/s41594-019-0218-x (2019).

8 Zhang, Z. et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat. Methods 18, 1213-1222, doi:10.1038/s41592-021-01280-7 (2021).

9 Dai, Q. et al. Ultrafast bisulfite sequencing detection of 5-methylcytosine in DNA and RNA. Nat. Biotechnol., doi:10.1038/s41587-023-02034-w (2024).

10 Liu, J. et al. Epitranscriptomic subtyping, visualization, and denoising by global motif visualization. Nat. Commun. 14, 5944, doi:10.1038/s41467-023-41653-4 (2023).