來源：生物探索 中山大學附屬腫瘤醫院廖雯婷團隊聯合黃慧琳及宋立兵團隊，在 Science 子刊 Science Immunology 上發表了題為：Oncogenic KRAS drives immunosuppression of colorectal cancer by impairing DDX60-mediated dsRNA accumulation and viral mimicry 的研究論文。 該研究揭示了癌基因KRAS破壞結直腸癌細胞內源性dsRNA穩態，擾亂“病毒擬態”效應，從而推動結直腸癌的免疫逃逸機制。這一發現為克服結直腸癌免疫治療耐藥性提供了新的思路。 癌基因KRAS的激活性突變在超過40%的結直腸癌中出現，是促進腫瘤免疫逃逸的關鍵因素。廖雯婷團隊此前在發表于 Cancer Cell 的研究（Cancer Cell. 2019 Apr 15;35(4):559-572.e7）中利用轉移性結直腸癌轉基因小鼠模型（iKAP）揭示了KRAS突變通過抑制結直腸癌細胞的干擾素（IFN）反應來誘導免疫抑制微環境，從而導致免疫檢查點耐藥。在該研究的延續性工作中，團隊繼續利用iKAP模型深入探討了KRAS抑制IFN反應的機制。iKAP模型中具有可誘導的KRASG12D突變，并通過強力霉素（Dox）實現對Apc和Trp53基因的條件性失活。 研究團隊采用多種經典雙鏈RNA（dsRNA）檢測方法，包括J2-免疫熒光染色、J2-免疫共沉淀結合dsRNA免疫印跡、J2抗體免疫共沉淀結合dsRNA RT-PCR，以及dsRNA提取結合RT-PCR，發現KRAS突變顯著降低了結直腸癌細胞內源性dsRNA的豐度，而抑制KRAS突變活性則顯著增加了細胞內dsRNA的水平。這些dsRNA主要來源于基因組的轉座元件（TE）、內源性逆轉錄病毒（ERV）以及線粒體基因。 進一步研究表明，KRAS突變并不影響這些基因序列的轉錄，而是通過降低轉錄后環節中dsRNA的半衰期來實現降低dsRNA豐度的。細胞內dsRNA可被RNA誘導的沉默復合體（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）降解。研究團隊還發現，KRAS突變不改變RISC關鍵組分DICER和AGO2的表達；敲除AGO2能顯著上調KRAS突變細胞中dsRNA總量，提示KRAS突變可能通過增強RISC介導的dsRNA降解來降低腫瘤細胞內的dsRNA水平。 此外，研究團隊還發現，KRAS突變的結直腸癌細胞對dsRNA的響應能力大大降低。這種能力的減弱意味著這些細胞無法有效啟動抗病毒免疫反應，其結果是干擾素刺激基因（ISG）的表達及MHC-I分子的抗原提呈功能受到抑制。通過使用合成的dsRNA類似物poly (I:C)進行實驗，研究團隊觀察到，在KRAS野生型細胞中，poly (I:C)能夠顯著提升IFN反應和MHC-I分子的抗原提呈功能。然而，在KRASG12D突變型結直腸癌細胞中，這些反應被削弱。當RIG-I樣受體（RLR）如RIG-I和MDA5識別并結合胞內病毒RNA后，這些受體的信號被傳遞到MAVS，導致MAVS在線粒體膜上發生聚集。在KRAS野生型細胞中，poly (I:C)處理可引起顯著的MAVs聚集；而在KRAS突變的細胞中，poly (I:C)處理引起的MAVS聚集顯著低于KRAS野生型細胞。這些實驗結果表明KRAS突變影響RLR/MAVS通路對dsRNA的響應能力，這一過程對于有效的免疫應答至關重要。 RNA結合蛋白（RBP）在保護RNA不被降解方面發揮著關鍵作用。它們通過多種機制影響RNA的命運，從而在細胞內的RNA穩態和基因表達調控中起核心作用。研究人員猜想，KRAS突變可能通過影響某種關鍵的RBP來調控dsRNA的穩定性。通過整合結直腸癌遺傳學特征和表達譜分析，DDX60被確定為可能參與維持dsRNA穩定性的候選 RBP。結直腸癌中DDX60具有5%左右的缺失突變，且與KRAS突變呈互斥關系。KRAS突變顯著抑制DDX60的表達。 團隊之前的研究（Cancer Cell. 2019 Apr 15;35(4):559-572.e7）數據表明，KRAS突變型結直腸癌中，JAK–STAT3信號通路顯著下調。STAT3 是IFN-α/β反應和抗病毒基因表達的關鍵轉錄因子，其活性依賴于GSK3β介導的磷酸化。由于KRAS/AKT信號能夠通過磷酸化抑制GSK3β的激酶活性，研究團隊推測，KRAS突變可能通過AKT-GSK3β-STAT3通路減少DDX60的表達。通過Western Blotting實驗，證實抑制KRAS活性或使用AKT抑制劑能顯著上調p-STAT3（Tyr705）和DDX60的表達。進一步通過CUT&Tag技術，明確了STAT3對DDX60的轉錄激活作用。這些數據證實，KRAS突變通過激活AKT-GSK3β通路，降低STAT3磷酸化水平，從而下調DDX60的表達。 DDX60具有dsRNA結合能力和RNA解旋酶活性，但其K791A位點突變會削弱這些活性。然而，DDX60 對 dsRNA 穩定性的影響尚不明確。為探索DDX60在dsRNA穩定性中的作用，研究團隊在KRAS突變型細胞中，構建了穩定過表達DDX60全長、解旋酶結構域及其突變體的細胞株，發現過表達DDX60全長及其解旋酶結構域能顯著恢復KRAS突變細胞中dsRNA豐度，并延長dsRNA半衰期，表明了DDX60在結直腸癌細胞中通過增強dsRNA穩定性來維持其穩態的關鍵作用。進一步通過RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation）實驗證明，DDX60可以與DICER競爭性結合dsRNA，從而避免dsRNA被RISC降解。 接下來，研究團隊探討了DDX60在調控抗腫瘤免疫中的作用，發現過表達DDX60在KRAS突變細胞中顯著激活了內源性IFN響應，促進MHC-I上調，并增強了卵清蛋白（OVA）257–264（SIINFEKL）肽的呈遞能力。此外，過表達DDX60顯著抑制了C57BL/6J小鼠中MC38K腫瘤的生長，然而在裸鼠中無此效果。同時，過表達DDX60增加了小鼠腫瘤中T細胞和CD8+ T細胞的浸潤。相反，敲低DDX60則消除了IFN響應和抗原呈遞能力，并在體內導致MC38腫瘤生長增加，同時減少了腫瘤內T細胞浸潤。這些結果表明，DDX60通過誘導病毒擬態效應促進抗腫瘤免疫浸潤，其生物學作用依賴于功能性免疫系統。 DDX60在誘導病毒擬態效應方面的作用提示其可能與免疫檢查點抑制劑協同增效。在抗PD-1和抗CTLA-4治療研究中，過表達全長DDX60或其解旋酶域的MC38K腫瘤相較于對照組表現出明顯的生長減緩。鑒于解旋酶結構域在dsRNA積累和病毒模擬上的效果與全長DDX60相似，研究團隊設計了一種治療性重組腺相關病毒9型（AAV9）載體，攜帶DDX60解旋酶結構域，稱為AAV-解旋酶。AAV-解旋酶與抗PD-1或抗CTLA-4治療聯合使用，顯著抑制腫瘤生長并提高生存率。這些實驗結果表明，DDX60的表達可增強過表達KRASG12D的結直腸癌細胞對免疫檢查點抑制劑的反應。 此外，為了驗證這些效應在人類結直腸癌中的適用性，研究團隊使用了腫瘤細胞和外周血單個核細胞（PBMC）與活化T細胞的共培養系統。他們使用了MSI-H細胞系HCT116和MSS細胞系SW620，二者均具有致癌KRAS突變，且DDX60低表達。實驗結果顯示，DDX60的過表達或KRAS的敲低均顯著增強了兩種細胞系對抗PD-1療法的反應。這表明，過表達DDX60或使用KRAS抑制劑能增強MSS和MSI-H 結直腸癌對免疫檢查點療法的敏感性。 研究團隊為了驗證這些效應在人類結直腸癌中的適用性，構建了腫瘤細胞和外周血單個核細胞（PBMC）以及活化T細胞的共培養系統，使用了MSI-H類型細胞HCT116和MSS類型細胞SW620，這兩者均具有KRAS突變且DDX60表達較低。實驗結果顯示，DDX60的過表達或KRAS的敲低顯著提高了兩種細胞系對抗PD-1療法的響應。這表明，過表達DDX60或使用KRAS抑制劑可以增強MSS和MSI-H結直腸癌對免疫檢查點療法的敏感性。 綜上所述，這項研究表明KRAS通過降低DDX60表達來破壞dsRNA穩態和病毒擬態效應，從而驅動結直腸癌免疫逃逸。KRAS參與AKT-GSK3β信號傳導以抑制STAT3磷酸化，從而抑制由p-STAT3介導的DDX60轉錄。靶向KRAS或者補充DDX60可以通過激活病毒擬態和天然免疫來釋放治療優勢，從而增強免疫檢查點治療的效果。 中山大學附屬腫瘤醫院廖雯婷研究員、黃慧琳研究員和宋立兵研究員為論文共同通訊作者，博士研究生周儀、張亞欣、李明周、明天為論文共同第一作者。