來源：生物探索 CRISPR相關轉座子（CAST）通過CRISPR系統實現RNA介導的大片段DNA定向移動。整個過程避免了暴露斷裂的DNA雙鏈，并且不依賴細胞自身的同源重組修復機制，這使得CAST系統在生物醫學研究和遺傳病治療中具有巨大的應用潛力。CAST系統主要來源于Tn7-like轉座子家族。 近年來，研究人員對不同類型的CAST系統（如V-K【1】、I-B【2】和I-F【3】）的分子機制有了深入理解【4】。雖然這些系統在招募蛋白質的方式上有很大差異，但它們的核心機制類似：CRISPR模塊首先精準識別靶位點，接著核酸酶TnsA和轉座酶TnsB識別并切割轉座子DNA的末端。在調控蛋白TnsC的幫助下，轉座子DNA被準確插入靶位點。CRISPR模塊與轉座模塊通過TniQ蛋白（TnsD同源蛋白）連接，從而實現了RNA介導的轉座過程。此前的研究多集中于CRISPR模塊如何識別靶點并通過TniQ連接兩個功能模塊【5-14】。雖然V-K CAST系統完整轉座復合體的結構在之前已經被解析【15】，但由于該系統缺少大部分系統中都存在的核酸酶TnsA，無法完全解釋TnsA、TnsB和TnsC在轉座過程中的合作機制。此外，某些CAST系統（如I-B和I-D【16,17】）保留了Tn7系統中由TnsD介導的DNA整合方式，TnsD如何識別特定DNA序列并招募TnsABC復合物，仍需進一步研究。 2024年10月8日，美國普渡大學暢磊福研究團隊在Cell雜志上發表了題為TnsABCD轉座體的結構揭示了靶向DNA轉座的機制的研究論文【18】。該研究以來自地衣中的藍細菌共生體Peltigera membranacea cyanobiont 210A 的I-B 型CAST（PmcCAST）為研究模型，通過冷凍電鏡（cryo-EM）和生化分析的方法，首次揭示了TnsD如何識別特定的tRNA-Val基因并招募TnsABC蛋白復合體，完成定點的DNA插入。 結合2023年報道的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC復合體的結構模型【14】，團隊搭建了完整的PmcCascade-DNA-TniQ-TnsC-TnsAB復合體的結構模型，并對兩種DNA整合機制的效率和特異性進行了比較和討論。團隊在Tn7-like轉座復合體TnsABCD-DNA和TnsC-TnsD-DNA的分子結構中發現了很多有趣的分子間相互作用。這一研究成果不僅為 CAST系統的開發應用提供了新思路，還進一步加深了對轉座機制的理解。 值得一提的是，TnsABCD介導的轉座是經典的Tn7-like轉座子通路，從Tn7早期研究至今已有30余年歷史，而本研究首次解析了該完整復合體的結構。 該研究的主要發現如下 （圖1）： （1） 在TnsC-TnsD-DNA復合體和TnsABCD-DNA復合體中，靶標DNA（Target DNA）都呈現出彎曲狀態。特別值得注意的是，TnsD中的R445氨基酸殘基嵌入CC/GG堿基對之間，進一步影響DNA的形變。當R445突變成丙氨酸后，轉座活性顯著下降，且在TnsC-TnsDR445A 系列-DNA的冷凍電鏡結構中，TnsD的C端識別序列的結構域不再可見。這表明，R445殘基嵌入DNA對于識別靶序列和形成穩定的TnsC-TnsD-DNA復合體至關重要。 （2） TnsC通過與TnsB的C端尾部相互作用，招募TnsB參與轉座過程。在TnsC的七聚體中，有4個亞基顯示出多余的TnsB的C端尾部的密度圖。這表明，形成穩定的TnsC七聚體對于有效招募TnsB十分重要。 （3） TnsC的C端尾部位于TnsA、TnsB和DNA的交界處，直接參與了TnsAB-DNA鏈轉移復合物（Strand transfer complex）的組裝，且相互作用的氨基酸在I-B型CAST系統中具有保守性。 （4） TnsA的核酸酶結構域與TnsB的RNaseH-like結構通過延伸的β折疊片相互作用。TnsA的DNA底物在–3和–4之間的磷酸二酯鍵離其活性中心最近。這一結構觀察與先前原始Tn7的生化數據顯示的TnsA和TnsB切割位點相差3個堿基的結果相一致。 （5） TnsD介導的DNA整合與RNA介導的DNA整合在靶標DNA的識別區域上有所不同，導致插入位點與識別位點之間的距離差異。這兩種整合方式效率的不同，可能與TnsC七聚體的穩定性有關。在TnsD介導的整合中，TnsD與TnsC存在兩個接觸面，且DNA的嵌入可能進一步增強了TnsC在目標DNA上的穩定性。 總之，本研究加深了我們對Tn7-like轉座子和CAST系統中DNA靶向插入的結構和機制的理解，為將該系統開發成精準DNA插入工具的研究奠定了基礎。 1. Strecker， J.， Ladha， A.， Gardner， Z.， Schmid-Burgk， JL， Makarova， KS， Koonin， EV 和 Zhang， F. （2019）。使用 CRISPR 相關轉座酶進行 RNA 引導的 DNA 插入。科學 365， 48-53。10.1126/science.aax9181。 2. Saito， M.， Ladha， A.， Strecker， J.， Faure， G.， Neumann， E.， Altae-Tran， H.， Macrae， RK和Zhang， F.（2021 年）。CRISPR 相關轉座子歸巢的雙模式。單元格 184， 2441-2453 e2418。10.1016/j.cell.2021.03.006. 3. Klompe， SE， Vo， PLH， Halpin-Healy， TS 和 Sternberg， SH （2019）。轉座子編碼的 CRISPR-Cas 系統直接 RNA 引導的 DNA 整合。自然 571， 219-225。10.1038/s41586-019-1323-z。 4. Hsieh， SC 和 Peters， JE （2024）。具有 CRISPR 相關 Tn7 樣轉座子的天然和工程向導 RNA 定向轉座。Annu Rev Biochem 93， 139-161。10.1146/annurev-biochem-030122-041908。 5. Halpin-Healy， TS， Klompe， SE， Sternberg， SH 和 Fernandez， IS（2020 年）。轉座子編碼的 CRISPR-Cas 系統靶向 DNA 的結構基礎。自然 577， 271-274。10.1038/s41586-019-1849-0。 6. Jia， N.， Xie， W.， de la Cruz， MJ， Eng， ET 和 Patel， DJ （2020）。通過 CRISPR-Cas-轉座子復合物整合 DNA 的初始步驟的結構-功能見解。細胞研究 30， 182-184。10.1038/s41422-019-0272-2。 7. 李 Z.、張 H.、肖 R. 和張 L.（2020 年）。與轉座蛋白 TniQ 結合的 I 型 CRISPR RNA 引導監測復合物的冷凍電鏡結構。細胞研究 30， 179-181。10.1038/s41422-019-0268-y。 8. Petassi， MT、Hsieh， SC 和 Peters， JE （2020）。向導 RNA 分類可在 Tn7-CRISPR-Cas 轉座子中選擇靶位點。細胞 183， 1757-1771 e1718。10.1016/j.cell.2020.11.005。 9. Wang， B.， Xu， W.， 和 Yang， H. （2020）。Tn7 樣轉座酶募集和 DNA 加載到 CRISPR-Cas 監視復合物的結構基礎。細胞研究 30， 185-187。10.1038/s41422-020-0274-0。 10. Park， JU， Tsai， AW， Mehrotra， E.， Petassi， MT， Hsieh， SC， Ke， A.， Peters， JE 和 Kellogg， EH （2021）。RNA 引導的 DNA 轉座系統中靶位點選擇的結構基礎。科學 373， 768-774。10.1126/science.abi8976 的。 11. Querques， I.， Schmitz， M.， Oberli， S.， Chanez， C.， 和 Jinek， M. （2021）。通過 V 型 CRISPR 轉座子系統選擇和重塑目標位點。自然 599， 497-502。10.1038/s41586-021-04030-z。 12. Xiao， R.， Wang， S.， Han， R.， Li， Z.， Gabel， C.， Mukherjee， IA， 和 Chang， L. （2021）。CRISPR-Cas12k 識別 RNA 引導的 DNA 轉座靶 DNA 的結構基礎。分子細胞 81， 4457-4466 e4455。10.1016/j.molcel.2021.07.043. 13. Schmitz， M.， Querques， I.， Oberli， S.， Chanez， C. 和 Jinek， M. （2022）。組裝 V 型 CRISPR 相關轉座子復合物的結構基礎。單元格 185， 4999-5010 e4917。10.1016/j.cell.2022.11.009. 14. Wang， S.， Gabel， C.， Siddique， R.， Klose， T.， 和 Chang， L. （2023）。IB 型 CRISPR 效應子募集 Tn7 樣轉座子的分子機制。單元格 186， 4204-4215 e4219。10.1016/j.cell.2023.07.010. 15. Park， JU， Tsai， AW， Rizo， AY， Truong， VH， Wellner， TX， Schargel， RD 和 Kellogg， EH （2023）。全息 CRISPR RNA 引導的轉座子整合復合物的結構。自然 613， 775-782。10.1038/s41586-022-05573-5。 16. Faure， G.， Saito， M.， Benler， S.， Peng， I.， Wolf， YI， Strecker， J.， Altae-Tran， H.， Neumann， E.， Li， D.， Makarova， KS， et al. （2023）。Tn7 轉座子中靶標選擇者的模塊化和多樣性。分子細胞 83， 2122-2136 e2110。10.1016/j.molcel.2023.05.013. 17. Hsieh， SC 和 Peters， JE （2023）。在藍細菌的不同 Tn7 樣元件中鑒定的新型 I-D 型 CRISPR 引導的轉座子的發現和表征。核酸研究 51， 765-782。10.1093/nar/gkac1216 的。 18. Wang， S.， Siddique， R.， Hall， MC， Rice， PA 和 Chang， L. （2024）。TnsABCD 轉座體的結構揭示了靶向 DNA 轉座的機制。細胞。